Probensicherheit - Arbeitssicherheit - Alterung

⇒ Dichtheitsbewertung für reale Transport- und Lagerbedingungen

⇒ Differenzierte und quantitative Resultate

⇒ Simulation langer Lagerzeiten

Im Zuge des technischen Fortschritts und der zunehmenden Laborautomatisierung geht der Trend im Biobanking hin zu längeren Lagerzeiten und steigenden Probenzahlen. Während moderne Biobanken vor wenigen Jahren noch für eine maximale Lagerkapazität von 10.000 – 20.000 Proben konzipiert waren, werden heute im Rahmen großer Kohortenstudien zur Untersuchung der Volksgesundheit bereits Lagerkapazitäten von mehr als 20 Millionen Proben realisiert und das Banking autologer Stammzellen für personalisierte Therapien erfordert eine lebenslange, vitalitätserhaltende Lagerung.

Das Biobanking medizinischen Probenmaterials stellt dabei höchste Anforderungen an die verwendeten Packmittel. Auch nach langen Transport- und Lagerzeiten muss die Vitalität des kryokonservierten Zellmaterials garantiert werden und aus den eingelagerten medizinischen Proben sollen vertrauenswürdige Analysenergebnisse resultieren. Dies gilt für jede unwiederbringliche Probe und definiert so spezifische Anforderungen an jedes einzelne Probenröhrchen.

Wir prüfen, ob Ihre Primärpackmittel diesen Anforderungen gewachsen sind. Unsere Methoden ermöglichen eine quantitative Bewertung der Produktqualität und damit eine vergleichende Bewertung alternativer Produkte beim Anwender. Wir decken materialspezifische und konstruktive Schwächen detailliert auf und liefern wichtige Hinweise für die applikationsspezifische Eignung kryogener Packmittel und konstruktive Verbesserungsmöglichkeiten. So tragen wir dazu bei, dass Ihre Proben Lager- und Transportvorgänge sicher und ohne qualitative Beeinträchtigung überstehen.

Durch Transportsicherheitsuntersuchungen weisen wir die Eignung kryogener Packmittel für den Straßen- und Lufttransport in Übereinstimmung mit den bestehenden Sicherheitsrichtlinien für den Transport biologischer Proben nach. Unser Test auf CO₂-Dichtheit ermittelt das Risiko einer Probenkontamination beim Transport auf Trockeneis.

Im Rahmen von Lagersicherheitsuntersuchungen weisen wir die Dichtheit und Materialbeständigkeit der Packmittel unter den Bedingungen einer kryogenen Lagerung nach. Im Vordergrund stehen das chemisch-physikalische Materialverhalten im Abkühl- und Aufwärmprozess sowie die Beständigkeit gegen das Eindringen flüssigen Stickstoffs und die sich daraus ergebende Berstgefahr beim Auftauen der Packmittel.

Im Rahmen von Aging-Untersuchungen wird die Packmittelbeständigkeit während langer Lagerzeiten geprüft. Nach der Simulation eines Kryobanking-Szenarios mit einer realen Lagerdauer von mehreren Jahren oder Jahrzehnten werden die Packmittel verschiedenen Tests zum quantitativen Nachweis einer Materialalterung unterzogen. Dies kann im einfachsten Fall die Bestimmung von Dichtheit und Berstdruck sein. Darüber hinaus können Zug- und Druckfestigkeit, Permeabilität und Dichtheit des Verschlusssystems, aber auch detailliert und temperaturabhängig untersucht werden, um die Ursachen der Materialalterung aufzuklären.

Leaching-Untersuchungen ermitteln eine potentielle Kontaminationsgefahr der Probe durch auslaugbare Bestandteile der verwendeten Kunststoffe oder den Übertritt verschleppter Hilfsstoffe aus dem Produktionsprozess, beispielsweise von Reinigungs- und Schmiermittelrückständen, in das Probengut.

Gravimetrischer Dichtheitsnachweis IATA/ADR

Während des Straßen- und Lufttransportes sind Probenpackmittel wechselnden physikalischen Bedingungen unterworfen. Einerseits können große Temperaturschwankungen auftreten, andererseits besteht insbesondere beim Lufttransport neben der allgemeinen Druckreduzierung im Frachtraum auch die Gefahr eines großen Druckabfalls im Havariefall. Beides  kann zu einer drastischen Erhöhung der Druckdifferenz über der Behälterwand führen, der im Dichtheitsverlust der Packmittel resultiert. Dies kann einerseits zur Verunreinigung der Proben führen, durch eine Freisetzung potentiell gesundheitsgefährdenden Probenmaterial, aber auch ein Risiko für die öffentliche Sicherheit bedeuten.

Der gravimetrische Dichtheitsnachweis dient dem Nachweis der Transportsicherheit biologischer Proben entsprechend der Vorgaben der IATA (International Air Transport Association) und des ADR (Europäisches Übereinkommen über die internationale Beförderung gefährlicher Güter auf der Straße). Die zu prüfenden Probenröhrchen werden mit einer volatilen Prüfsubstanz befüllt, nach Herstellerangaben verschlossen und tiefgekühlt. Anschließend werden sie in einer Vakuumprüfkammer einem definierten Druck-Temperaturregime unterworfen. Bei einem Differenzdruck von 95 kPa erfolgt eine langsame Erhöhung der Probentemperatur von −40 °C bis +55 °C. Der Test simuliert den maximalen physikalischen Stress durch die Umgebungsbedingungen, dem die befüllten Packmittel beim Lufttransport ausgesetzt sind. Kann durch Differenzwägung ein Verlust an Prüfsubstanz ermittelt werden, besteht die Gefahr eines Dichtheitsverlustes im Transportprozess und das Packmittel erhält keine Transportzulassung.

Nachweis der Probensicherheit beim Transport auf Trockeneis

Trotz verschiedener Alternativen erfolgt der Transport gefrorener Proben in vielen Fällen auch heute noch in Styroporbehältern direkt auf Trockeneis. Durch den günstigen Preis und die große Wärmekapazität sind selbst mehrtägige Transporte in ungekühlten Transportmitteln kostengünstig durchführbar. Es besteht jedoch die Gefahr einer Akkumulation von Kohlensäure im Probengut im Falle einer Packmittelundichtheit. Bereits nach kurzer Zeit bildet sich in der Transportbox durch die Sublimation des Trockeneises eine gesättigte CO₂-Atmosphäre aus. Gleichzeitig besteht die Gefahr einer verschlechterten Dichtwirkung der Probenröhrchen durch negative Wärmeausdehnungseffekte beim Kalttransport, die zu einer Kontamination des Packmittels mit CO₂-Gas führt. Nach dem Auftauen der Proben kann daraus ein drastischer Abfall des pH-Wertes resultieren, der zu einer Schädigung der Probe führt.

Deshalb ermitteln wir mit unserem CO₂-Dichtheitstest die CO₂-Aufnahme ins Probengut nach der Simulation realer Transportbedingungen. Analog zum gravimetrischen Dichtheitsnachweis ermöglicht auch der CO₂-Dichtheitstest eine quantitative Aussage für jedes einzelne Probenröhrchen. Aus den Daten lassen sich Aussagen zur Performance der Röhrchen und zu notwendigen Qualitätssicherungsmaßnahmen für den Hersteller ableiten.

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Nachweis der Dichtheit gegen flüssigen Stickstoff (LN₂)

In vielen Biobanken erfolgt die Lagerung der Packmittel in der Gasphase über flüssigem Stickstoff. Bei Lagertemperaturen unterhalb von -130 °C lässt sich mit dieser Lagermethode eine nahezu unbegrenzte Lagerdauer realisieren, ohne dass ein Vitalitätsverlust von Zellen und Geweben oder eine Qualitätsminderung des biologischen Probenmaterials eintritt. Oftmals kommen die Proben während der Lagerung jedoch gewollt oder ungewollt in direkten Kontakt mit flüssigem Stickstoff. Auch wenn der Hersteller seine Produkte nicht für diesen Einsatzzweck spezifiziert, werden kryogene Probenröhrchen gerade in kleineren Laboren oft direkt in LN₂ überführt, um eine schnelle Abkühlung des Inhaltes zu ermöglichen oder die vorhandene Lagerkapazität besser ausnutzen zu können. Auch durch ein ungewolltes Überfüllen des Lagertanks oder das Lösen einer Probenhalterung bei der Tankbeschickung oder Probenentnahme kann es zum direkten Kontakt von Probenpackmittel und flüssigem Stickstoff kommen. Auch in diesen Fällen sollte das Packmittel dicht sein, denn das Eindringen von LN₂ in das Primärpackmittel kann gravierende Probleme verursachen:

• Risiko der Probensicherheit bei permanenter Undichtheit
  

Versagt das Dichtsystem des Röhrchens durch die starke Abkühlung permanent, dringt flüssiger Stickstoff in das Probenröhrchen ein. Trotz aller Sicherheitsmaßnahmen können so gefährliche Keime, wie Bakterien, Viren und Mykoplasmen mit dem LN₂ in die Probe eindringen. Auch eine Kreuzkontamination der Proben durch die Verschleppung von Probenmaterial ist möglich, so können Infektionen übertragen und ─ beispielsweise bei DNA ─ Probenmerkmale verfälscht werden.

• Risiko der Arbeitssicherheit beim Rückdichten des Röhrchens

Bei geringen Undichtigkeiten im Kalten kommt es durch die Wiedererwärmung bei der Probenentnahme zu einem partiellen oder vollständigen Rückdichten der Probenröhrchen. Die Verdampfung des akkumulierten Flüssigstickstoffs im Packmittel kann einen extremen Druckanstieg zur Folge haben, der ein spontanes Bersten der Röhrchen während der Entnahme aus dem Lagertank oder beim Öffnen verursacht und dadurch auch das Laborpersonal gefährden kann.

Die Dichtheitsprüfung erfolgt durch das Befüllen der Packmittel mit zwei farblich verschiedenen, porösen Mikrogranulaten in definierter Schichtung. Durch Bewertung des Mischeffektes beider Indikatoren und einen Residualdrucknachweis nach einer mehrstündigen LN₂-Inkubation kann das Dichtverhalten der Packmittel präzise bewertet und ein potentielles Sicherheitsrisiko zuverlässig beurteilt werden.

Die Kombination von Residualdrucknachweis und sichtbarem Mischeffekt erlaubt eine differenzierte Bewertung des Dichtverhaltens für jedes einzelne Packmittel. Durch eine statistische Auswertung der Effekte ermöglicht auch dieser Test Rückschlüsse auf die Ursache der Qualitätsprobleme.

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Große Biobanken existieren bereits seit dem ausgehenden 20. Jahrhundert. Die ältesten Probenchargen erreichen mittlerweile Lagerzeiten von deutlich mehr als 20 Jahren. Aktuelle medizinische Kohortenstudien sind oft für Lagerzeiten von bis zu 30 Jahren konzipiert und die Aufbewahrung patientenbezogener Stammzellen (Nabelschnurblut) für Therapiezwecke erfordert eine lebenslange Lagerung. Für die verwendeten Probenpackmittel ergibt sich damit immer häufiger die Frage der Langzeitstabilität und des langfristigen Erhalts der Probenqualität unter kryogenen Bedingungen.

Unser Aging-Test ermöglicht Aussagen über die Packmittelalterung durch lange Lagerzeiten mit einem potentiellen Einfluss auf die Arbeits- und Probensicherheit. Der Hauptfaktor für eine schleichende Alterung von Kunststoff und Dichtsystem ist nicht die kryogene Lagerung. Temperaturen unterhalb von -130 °C halten eine Alterung von Packmaterial und Probe fast vollständig auf. Einen kritischen Einfluss haben dagegen wiederholte thermische Wechselbelastungen, die durch Phasenumwandlungsprozesse zur Materialermüdung führen. Regelmäßige Unterbrechungen der kryogenen Lagerung für die bedarfsorientierte Probenentnahme bedeuten thermischem Stress für alle Probenröhrchen im betroffenen Rack und können deren Materialalterung stark beschleunigen.

Um die alterungsrelevante Materialbelastung bestmöglich nachzubilden, simuliert unser Aging-Test mit mehrfachen Entnahme- und Beladungszyklen typische Biobanking-Szenarien. Die Test­bedingungen können an die realen Aufgabe- und Lagerbedingungen sowie die Entnahmeszenarien realer Kryobanken angepasst werden. Mit Heizraten von bis zu 60 K/min und Abkühlraten bis 100 K/min können hunderte Entnahmezyklen in kurzer Zeit simuliert werden. Durch umfassende Material- und Dichtheitsprüfungen nach der simulierten Langzeitlagerung können potentielle Schwachstellen der Kryoröhrchen sicher aufgedeckt werden.

Durch einen Vergleich der Eigenschaften fabrikneuer und thermisch gealterter Röhrchen kann die Packmittelalterung für reale Biobanking-Szenarien qualitativ und quantitativ beurteilt werden. Neben Dichtheitsprüfungen stehen weitere Prüfmethoden für eine differenzierte Packmittelbewertung zur Verfügung:

• Thermische Analysen

Ermitteln kritische physikalische Zustände des Packmittelmaterials beim Durchlaufen des Temperaturbereiches zwischen Probenbeschickung und Lagerung in der Biobank. Phasenübergänge des Kunststoffs können die physikalischen Eigenschaften, wie Festigkeit und Gasdichtheit der Probenröhrchen in bestimmten Temperaturbereichen drastisch ändern.

• Temperaturabhängige Permeationsprüfungen

Bewerten Änderungen der Gasdichtheit von Wandmaterial und Verschlusssystem des Packmittels. Die Prüfung kann bei verschiedenen Temperaturen erfolgen, beispielsweise bei Beschickungs- und Lagertemperatur in der Kryobank oder in kritischen Temperaturbereichen (Glastemperaturen und Phasenübergangstemperaturen der verwendeten Polymere).

• Temperaturabhängige Zugfestigkeitsprüfungen und Bestimmung des Berstdrucks

Die Berstdruckprüfung ermittelt den Einfluss der Materialalterung auf die Druckfestigkeit der Packmittel. Gemessen wird der Innendruck, der aufgrund einer Volumenexpansion eingedrungenen Flüssigstickstoffs oder kondensierender, im Packmittel akkumulierter Luftbestandteile (Sauerstoff, Kohlendioxid) beim Auftauen zum Bauteilversagen führen würde. Das resultierende Schadensbild kann mikroskopisch bewertet werden. Durch temperaturabhängige Zug- und Druckfestigkeitsprüfungen bei verschiedenen Temperaturen kann das mechanische Materialverhalten beim Abkühlen der Packmittel anhand verschiedener Kennwerte genau charakterisiert werden.

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Im Fertigungsprozess von Plastikartikel kommen Grundstoffe, Halbzeuge und Fertigprodukt auf vielfache Weise in Kontakt mit Produktionshilfsstoffen. Rückstände von Schmiermitteln, Trennmittel oder Reinigungs- und Lösungsmitteln können auf dem Material verbleiben und während der Lagerung in die Probe übertreten. Dies ist insbesondere bei Probenröhrchen für Zellmaterial oder medizinisches Untersuchungsgut hoch problematisch, da auslaugbare Bestandteile des Kunststoffes oder chemische Rückstände aus dem Produktionsprozess die Vitalität kryokonservierter Zellen beeinträchtigen und Untersuchungsergebnisse medizinischer Proben verfälschen können.

Im Rahmen von Leaching-Tests werden lösliche Rückstände extrahiert und mit modernen chromatographischen Verfahren konzentriert und analysiert. So können selbst geringste Spuren auslaugbarer Inhaltsstoffe und problematischer Rückstände wie Amide, Ester, Aldehyde oder Fettsäuren im Material oder auf der Oberfläche der Probenröhrchen sicher nachgewiesen werden. Ein negatives Testergebnis kann die Unbedenklichkeit der Packmittel für die kryogene Lagerung empfindlicher Proben auf der chemisch-materialwissenschaftlichen Ebene nachweisen.

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